ELISA素來以靈敏度較高、特異性較好的特點在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。而它作為經(jīng)典的免疫檢測方法,雖然看似平常但是要真正將該實驗做好并不容易,酶標(biāo)板的讀值總是會不盡如人意,可見實操中的各個環(huán)節(jié)對該實驗的檢測效果影響較大,如不注意,就會產(chǎn)生一些糟心的實驗結(jié)果。
問題1:低信號強度
如果ELISA讀數(shù)低于吸光度下限(<000),且目標(biāo)樣本濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍,則進(jìn)行分析的樣本濃度可能太低,或者儀器所能分析的樣本檢測最佳條件可能未被滿足。在這種情況下,樣本所產(chǎn)生的檢測信號應(yīng)該需要被級聯(lián)放大。
解決方案:
1.增加抗體的孵育時間。如果依照protocol在室溫下孵育您的抗體2小時后的實驗結(jié)果并不理想,那么可以嘗試在4°C孵育過夜。如此,可允許抗原抗體最大程度上的結(jié)合,并能擴大ELISA中的反應(yīng)信號。
2.增加二抗-酶結(jié)合物的濃度。ELISA中的E代表酶(通常是辣根過氧化物酶,HRP),它與底物(通常是TMB)反應(yīng)后可產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)色。因而,將HRP濃度提高50%或?qū)⑵浼颖叮瑒t會產(chǎn)生更強的顏色,易于檢測。
3.充分避光,以保護(hù)TMB基質(zhì)不受光照影響,并確保其能最大限度地發(fā)揮其性能??紤]到TMB對光線非常敏感,因而在黑暗中進(jìn)行ELISA平板的顯色反應(yīng)會產(chǎn)生更強的信號。
問題2:高背景
ELISA板上的空白孔通常被用作為陰性對照,當(dāng)該組中任意孔的讀數(shù)明顯大于0,這均表示實驗背景有問題。
解決方案:
1.室溫過高,可能會導(dǎo)致實驗結(jié)果偏高。因而,如果發(fā)現(xiàn)所有的實驗孔的讀數(shù)均偏高,請注意控制恒溫箱溫度,盡可能將其穩(wěn)定在37℃左右。
2.平板孔內(nèi)因清洗不徹底,而導(dǎo)致有酶或底物殘留,同樣會產(chǎn)生高背景。此時需要按照protocol對ELISA平板進(jìn)行清洗,可不任意減少洗板液的體積以及洗板次數(shù),同時也需要按要求操作,并適當(dāng)延長清洗液浸泡孔的時間。
3.加樣或加酶時導(dǎo)致了陰性孔的污染。此時需要及時更換吸頭以避免造成污染,切忌僥幸心理。
4.試劑過期或被污染。實驗操作過程中不要使用過期試劑,并防止組分污染。如使用容器時,應(yīng)注意容器的清潔。
問題3:重復(fù)性不好
同一個樣本間的各個復(fù)孔的讀數(shù)有顯著性差異。
解決方案:
1.加樣量多少不一,操作時間長短不一。重復(fù)同一樣本時,加樣量與加樣時間理應(yīng)相同,同時也應(yīng)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后可輕微晃動酶標(biāo)板使反應(yīng)液充分混合。
2.樣本應(yīng)保證一致、無污染,并應(yīng)該由同一名操作人員進(jìn)行操作。
3.精密度測定方法不標(biāo)準(zhǔn),此時理應(yīng)采用正確的方法進(jìn)行操作。
問題4:干擾
干擾物質(zhì)如清洗劑或NADH(存在于血清中)可能會影響ELISA平板的吸光度讀數(shù)并使得實驗結(jié)果偏離真實結(jié)果。
解決方案:
1.嚴(yán)格按照protocol進(jìn)行實驗操作。通常protocol中會指出會對實驗產(chǎn)生干擾的化學(xué)物質(zhì),以及會告知實驗者如何避免它們。比如在進(jìn)行血紅蛋白干擾的血清測定中,通常會建議不要使用溶血的血清樣品。
2.有時可能你也別無選擇,只能使用含有干擾物質(zhì)的樣品。如果你感興趣的抗原濃度較高,可以使用一個濃度較低但仍易于檢測的樣品稀釋液,如此可以稀釋樣本中的干擾物質(zhì)并降低其對實驗的干擾。
問題5:陽性與陰性不能達(dá)到2.1的比值
陰性顏色太深,又或者陽性顏色太淺。
解決方案:
1.當(dāng)陰性顏色太深時,則陰性對照(也就是陽性對照的除目標(biāo)抗原外的其它成分)中可能有某種成分與一抗作用。此時可通過純化抗原除去干擾成分。
2.當(dāng)陽性顏色太淺時,原因可能有3個:一抗效價不好,換用一抗或增加一抗用量;抗原太稀,增加抗原濃度;封閉時間過長,應(yīng)縮短封閉時間,封閉時間一般37攝氏度2個小時,或者4攝氏度過夜。
問題6:增加抗原濃度,一抗?jié)舛炔蛔?,顯色反應(yīng)沒有表現(xiàn)出應(yīng)有的梯度
一抗與抗原的比例已經(jīng)飽和。
解決方案:
增加一抗用量; 或在一抗用量不變的情況下減少抗原濃度做梯度。
問題7:增加一抗?jié)舛?,抗原濃度不變,顯色反應(yīng)沒有表現(xiàn)出應(yīng)有的梯度
一抗與抗原的比例已經(jīng)飽和。
解決方案:
增加抗原用量;或在抗原用量不變的情況下減少一抗?jié)舛茸鎏荻取?/p>
問題8:加完TMB顯色后顏色梯度很明顯,但加了硫酸終止反應(yīng)后顏色梯度沒有那么明顯了?
硫酸可能把其它成分都炭化了
解決方案:
加少一點硫酸,參考值:50 μlTMB+35 μl硫酸;或者采用1M的HCL作為終止液,50ulTMB+50ul1M HCL。
其它ELISA問題見:常見問題
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